华体会app t-DNA插入突变的检测

日期:2021-04-02 02:21:25 浏览量: 151

T-DNA插入突变体鉴定实验时间:2012年摘要Ti质粒上有一个特殊的DNA片段。当农杆菌感染植物细胞时,该DNA片段可以自发转移到植物细胞中并插入植物染色体DNA中。因此,Ti质粒上的可转移DNA称为T-DNA。将感兴趣的基因修饰插入T-DNA片段中,用土壤杆菌感染植物细胞,以外源基因实现植物的遗传转化,得到含有突变的植物。该实验是为了检测所获得的植物是否为T-DNA插入突变体。引言Ti质粒是农杆菌的天然质粒。该质粒上有一个特殊的DNA片段。当农杆菌感染植物细胞时,该DNA片段可以自发转移到植物细胞中并插入植物染色体DNA中。 Ti质粒上的可转移DNA称为T-DNA。如果修饰了Ti质粒,则将目的基因放入T-DNA序列中炸金花棋牌 ,农杆菌感染植物细胞以通过外源基因实现植物的遗传转化。 T-DNA插入植物染色体的位置是随机的。如果将T-DNA插入功能基因,特别是外显子区域,则会导致基因功能丧失。因此,使用农杆菌Ti质粒转化植物细胞是获得植物突变体的重要方法。根癌农杆菌Ti质粒转化植物细胞后,获得的后代分离种群中有纯合突变体,杂合突变体和野生型T-DNA插入。

在研究突变体时,所需的材料是纯合突变体,因此必须从分离的群体中鉴定出纯合突变体。在该实验中,使用液体CTAB(或TSP方法)从拟南芥植物中提取DNA,然后使用PCR扩增获得的DNA。之后,使用琼脂糖凝胶电泳技术分离具有不同长度的DNA条带。检查样品是否纯净,具有T-DNA插入突变。 PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应)是一种体外核算和扩增技术。它具有突出的优势,例如特异性,灵敏度,高产量钱柜体育 ,快速,简单,可重现和易于自动化。它可以在试管中得到您想要的东西。可以在几个小时内将研究目标基因或某个DNA片段放大到100,000甚至一百万次,以便肉眼可以直接观察和判断。 (PCR的基本原理如右图所示)DNA包含PO4基团,该基团在pH 8. 0Buffer(此实验中为TAE)中带负电荷,并在电场中向正极移动。在自由电泳过程中,由于不同大小的DNA片段的电荷密度大致相同,因此很难分离核酸分子。选择适当浓度的琼脂糖凝胶作为载体,使其具有一定的孔径,可以发挥分子筛作用使大小不同。核酸片段的迁移率差异较大突变体检测,可以达到分离的目的。标记电泳使用相同的条件;它在识别中起作用。不同浓度的琼脂糖凝胶对应于线性DNA分子的不同分离范围。

(下图)实验材料2. 1.测试拟南芥植物的材料;液氮,CTAB提取物华体会登录 ,氯仿/异戊醇(24:1),无水乙醇,70%乙醇,TE;引物(Lp,Rp,Bp),反应缓冲液,dNTP,ddH2O,耐热聚合酶;琼脂糖,TAE缓冲液离心机,恒温浴,PCR仪,电泳,电子天平,冰块;离心管(0. 2ml,0. 5ml),移液管和其他必要的实验设备2. 2.实验步骤2. 2. 1. CTAB法提取DNA 2. 2. 1. 1.用100mg液氮将幼叶磨成细粉华体会 ,放入1. 5 ml离心管中,加600的2CTAB提取物预热至65,轻轻摇晃混合2. 2. 1. 2. 65水浴30分钟,在此期间轻轻摇晃并混合2. 2. 1. [k23在室温下,向上清液中加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)),轻轻混合10分钟,以12000 rpm离心15分钟,然后将上清液转移到新的试管中。 k1] 1. 4.加2次在上清液中加入无水乙醇或等体积的异丙基,小心混合,在-20℃下以12000rpm离心15分钟30分钟,然后弃去上清液。 2. 2. 1. 5.用70%乙醇洗涤沉淀一次,以12000 rpm离心,并弃去上清液。 2. 2. 1. 6.干燥沉淀物,添加20-50 TE(pH 8. 0),65水浴30分钟以溶解DNA。

2. 2. 2. PCR步骤2. 2. 2. 1.配置反应系统:主要包括DNA模板,引物,反应缓冲液,dNTP,ddH2O,耐热聚合2. 2. 2. 2. 25ul系统:16ul ddH2O,缓冲液2. 5ul,镁离子2ul,dNTP 0. 5ul突变体检测,引物1ul,DNA模板2ul,taq酶0. 2ul。 2. 2. 2. 3.准备系统,轻轻摇晃使其混合,然后以4000rpm的速度离心10秒钟。 2. 2. 2. 4.设置反应程序:循环部分:变性和展开94.40秒;退火53,50秒;伸长72,80sec006直播 ,循环35 2. 2. 3.琼脂糖凝胶电泳2. 2. 3. 1.配置40ml 1. 6%琼脂糖凝胶:称取0. 640g琼脂糖成锥形烧瓶中,加入40ml TAE并加热使其溶解,注意不要碰到它。 2. 2. 3. 2.通过稍微加热约50来冷却溶解的琼脂糖凝胶,将所得溶液移入琼脂糖罐中,使其冷却并成型; 2. 2. 3. 3.将冷却并固化的琼脂糖凝胶放入电泳槽中,添加TAE电极缓冲液,直到液体略微浸入并固化2. 2. 3. 4.添加5ul 6将缓冲液加载到所得的25ul PC系统中,轻轻摇动以混合; 2. 2. 3. 5.用它将样品滴入斑点空气中,并向标记DNA中添加约6. 5ul。对于样品,将20ul滴加到每个斑点空白中; 2. 2. 3. 6.点样完成后,施加110v电压并运行凝胶约30-40分钟,直到DNA到达凝胶的第三部分。两个地方; 2. 2. 3. 7.取出凝胶,将其放入EB(溴化乙锭,强诱变剂,剧毒和谨慎接触)染色溶液中10-15分钟; 2. 2. 3. 8.然后将其放入凝胶成像仪中,观察在凝胶上运行的DNA。

结果3. 1.首次通过TPS法提取44号样品的DNA,将DL2000用作标记。根据上图的结果,根本看不到特定的DNA条带,它们都是非特定的小条带,其长度甚至比Marker DL2000的最短条带(100bp)小。无法判断被测样品是否纯合。 3. 2.发布了第二个CTAB,其使用Lambda DNA / EcoRI +作为标记物来提取44号样品的DNA。与第一次相比,有了很大的改进。对于这次使用的DNA标记LambdaDNA / EcoRI +,图中已标出了与每个条带相对应的DNA片段的大小。在Lp和Rp引物上扩增,电泳可获得约1100条DNA大条带,Bp,Rp引物可扩增,电泳可获得800〜900条小条带,因此可以确定样品(第44号)是杂合的。突变体。 3. 3.使用第三种CTAB方法提取样品44的DNA(与第二次相同),将BenchTop 100bp DNA Ladder用作标记。这次的结果与第二次获得的结果基本相同,并且也可以获得与3. 2相同的结论。分析4. 1.结果分析4. 1. 1. 4. 1. 1.中显示的实验结果不成功:所有DNA模板的扩增结果仅显示非特异性条带,而没有特定频段的痕迹。 进行初步分析有两个原因。一种是PCR扩增系统未均匀混合,添加的试剂附着在离心管的内壁上。另一个是考虑到DNA的物理脆弱性,我们在电泳前添加样品缓冲液(6Loading Buffer)之后,为了混合均匀,我们使用了电动振动器。由于剧烈振动,DNA特异条带可能会破碎。

4. 1. 2.在4. 1. 2.中显示的总体结果很好,但是DNA标记的选择不是很好。可以将指示目标带的标记全部挤压在一起,并且有很多1500bp以上的标记,因此没有显示该实验效果的指示。 4. 1. 3. DNAMarker中显示的结果应该是适当的:每个长度的标记分布更均匀,目标长度几乎在所有所示长度的中间;从DNA凝胶电泳的距离来看,也更好:大约100bp非特异性条带靠近凝胶边缘,但不会耗尽,目标条带位于1/2 2/3,即适合观察。 4. 2.实验分析4. 2. 1.在添加液态氮以研磨叶片时,最好始终将液态氮保持在离心管中,如果需要继续添加液态氮,则一段时间后研磨。磨削时,液氮沸腾时很容易吹走磨碎的刀片。另一方面,在研磨时,必须迅速避免离心管上空气中的水蒸气凝结。 4. 2. 2. DNA具有一定程度的物理脆弱性,因此在提取过程中混合时必须缓慢摇动,并避免剧烈摇动。 4. 2. 3. DNA模板中的蛋白质,多糖和酚等杂质会抑制PCR反应;模板降解将导致PCR扩增中没有产物;过量添加模板也将导致非特异性扩增增加​​。底漆的长度应适当,避免二级结构和二聚体;避免反复冻融;如果浓度合适,太高会引起非特异性增加;如果浓度太低,将没有扩增产物。

如果Mg浓度太高,它将非特异性地增加。如果它太低,将不会有放大产物。 4. 2. 4. PCR所需的所有试剂均应无污染,并且应将冻融循环次数减至最少。 4. 2. 5.电泳电压通常根据5V / cm确定。在该实验中,所有电泳槽长约20cm,计算出的电压为100V,但根据第一个实验的结果,为30min,对于电压为100V的电泳,DNA距离不够,因此为了增加实验速度,在DNA范围内电压增加到110V。 4. 2. 6.再次强调,EB(溴化乙锭)是一种荧光染料,可以嵌入双链核酸碱基对平面之间,并在紫外线激发下发出橙红色光。波长为250〜310 nm。 ,常用于检测核酸分子。因此,它也是强诱变剂,并具有致癌作用。染色时一定要保护好它。